اسپکتروفتومتر یا طیف سنج، دستگاهی است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه گیری می کند. این کار با انکسار پرتو نور به طیف طول موج ها و آشکارسازی شدت ها با دستگاه باردار و نمایش نتایج به صورت گراف انجام می شود. در حقیقت این روش با استفاده از میزان جذب نور، تعیین غلظت می کند. این روش قابلیت اندازه گیری نمونه های فوق العاده کوچک را داشته لذا از آن برای تجزیه و تحلیل عناصر مولکول های RNA، DNA استفاده می شود.

نور از بسته های بسیار کوچکی به نام فوتون تشکیل شده است که انرژی هر یک از آنها به محض برخورد به یک الکترون منتقل می شود. تنها هنگامی انتقال رخ می دهد که انرژی فوتون ها برابر با انرژی مورد نیاز برای انتقال الکترون به لایه انرژی بعدی باشد. این پروسه که در آزمایش های محاسبه کیفیت و کمیت DNA موجود در محلول ها استفاده می شود، پایه طیف بینی جذبی را تشکیل می دهد. به طور کلی نور با طول موج و انرژی خاص به نمونه تابانده شده و مقدار مشخصی از انرژی آن جذب می شود. سپس با اندازه گیری انرژی رد شده از نمونه توسط یک فوتودتکتور، مقدار جذب تعیین می شود. اسپکتروفتومتر دستگاه پیچیده ای است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه گیری می کند. در این دستگاه نور توسط یک منبع نور تولید شده و پس از گذشتن از میان نمونه مورد نظر نور، به صورت طیفی منتشر می شود سپس به وسیله سنسور ها آشکارسازی شده و به صورت نتایج قابل کاربردی ترجمه می شود. خروجی اسپکتروفتومتر همیشه نموداری از شدت نور نسبت به طول موج است. داده هایی که برای تولید نمودار گردآوری شده، در جدولی از شدت نور و طول موج ذخیره می شود. مقدار گراف بیان کننده مقدار عبور یا مقدار جذب است. اسپکتروفتومتر های امروزی دیجیتالی بوده و به وسیله میکروپروسسور کنترل می شوند.
اجزا اسپکتروفتومتر
چهار بخش اصلی در اسپکتروفتومتر وجود دارد: منبع نور، نمونه، آشکارساز و مفسر.
منبع نور می تواند نور مرئی، مادون قرمز یا ماورا بنفش باشد. پس از منبع نور یک تک فام ساز (مونوکروماتور) وجود دارد تا نور تولید شده را فیلتر و توسط یک منشور یا توری پراش طول موج های خاصی را انتخاب کند. پس از گذشتن نور تولید شده از داخل نمونه و جذب بخشی از آن، پس از گذشتن از مجموعه ای از لنز ها، شکاف ها، آینه ها و فیلتر ها به سنسور ها رسیده و پس از تفسیر شدن به صورت نموداری در خروجی قرار می گیرد.

عملکرد دستگاه

مسیر نور

در حال حاضر دو منبع نور UV و VIS برای اسپکتروفتومتر وجود دارد. متداول ترین منبع نور برای تولید نور مرئی یک لامپ هالوژن تنگستن با طول موج بین ۲۰۰ و ۳۴۰ نانومتر است. نور از میان نمونه عبور کرده و از طریق شکافی وارد اسپکتروفتومتر می شود. شکاف نازک باعث پراکنده شدن نور و پخش به خارج می شود، از آنجا که دستگاه ها تنها یک باریکه نور دارند، در بیشتر موارد طول موج پرتو خوانده شده از نمونه دستخوش تغییر واقع می شود و برای اصلاح این امر از آینه های مقعر استفاده می شود. بدین ترتیب که نور توسط آینه های مقعر به شبکه پراکنده کننده منعکس شده و دوباره به آینه مقعر دیگری منعکس می شود. این آینه کانونی نور را به سمت آشکارساز متمرکز می کند. آینه هایی که امروزه مورد استفاده قرار می گیرند به سه دسته تقسیم می شوند. اولین دسته از شیشه ساخته شده و برای خواندن جذب در طول موج های UV بیشتر از 340 نانومتر استفاده می شود. دسته دوم از سیلیس گداخته یا کوارتز ساخته شده و به علت شفافیت بسیار زیاد می تواند در اندازه گیری جذب طیف های UV و VIS (800-200 نانومتر) استفاده شود و نوع سوم آینه های یک بار مصرف است که انواع مختلفی دارد. یک نمونه از آن از پلی متا اکریلیت بوده و تنها برای اندازه گیری طول موج های 280 تا 800 نانومتر استفاده می شود.
طبق آخرین تحقیقات آزمایشگاهی، منبع UV می تواند لامپ هیدروژنی فشار بالا یا لامپ دوتریوم باشد. هنگامی که میزان جذب در طیف UV اندازه گیری می شود، لامپ دیگر خاموش می شود و زمانی که اندازه گیری جذب در نور مرئی انجام می شود برعکس این مساله اتفاق می افتد که دلیل این امر جلوگیری از تداخل طول موج های غیر ضروری در نور منتشر شده از نمونه است.

آشکار ساز
در انتهای مسیر نور، آشکارساز وجود دارد که وظیفه آن اندازه گیری شدت نور تابیده شده از آینه ها و انتقال اطلاعات به کنتوری است که آنها را ثبت و مقدار را بر روی LCD به اپراتور نمایش دهد. امروزه دو نوع آشکارساز در اسپکتروفتومتر UV / VIS متداول است : فتوتیوب و فتومالتی پلایر تیوب.

فتوتیوب یا فتوسل با تولید یک جریان الکتریکی عمل می کند. وقتی یک فوتون به کاتد سلول ضربه بزند، الکترون به سمت آند رانده شده و بدین ترتیب جریان الکترونی به وجود می آید که مقدار آن به میزان انرژی فوتون بستگی دارد. تیوب فتومالتی پلایر که بسیار حساس تر است به قانون اثر فتوالکتریک پلانک استناد دارد. فوتون ها به سطح حساس تیوب ضربه زده و الکترون های اولیه را به حرکت در می آورند، با برخورد این الکترون ها با سطح بعدی الکترون های ثانویه نیز رها می شوند. این روال به همین ترتیب ادامه پیدا می کند تا به آند برسند و جریان الکتریکی راه بیفتد. جریان تولید شده چندین بار تقویت می شود تا بتواند انرژی بسیار پایین یک فوتون را آشکار سازی و ثبت کند.

دستگاه باردار (CCD)
آشکارساز در بیشتر اسپکتروفتومتر ها یک دستگاه باردار خطی (CCD) است.  CCD نوعی سنسور است که نور را حس می کند و از مدار های مجتمعی مشتمل بر جفت خازن های کوپل شده حساس به نور تشکیل شده است. این خازن ها شدت نور دریافتی را حس کرده و آن را به سیگنال الکتریکی تبدیل می کند. آشکار ساز خطی CCD مشابه دامنه طول موج ها در اسپکتروفتومتر دستی است. هر پیکسل در CCD نشان دهنده طول موج خاصی از نور است و فوتون های جذب شده بیشتر، سیگنال های الکتریکی بیشتری تولید می کند. بنابراین سیگنال های الکتریکی خروجی CCD در هر پیکسل، برابر نسبت شدت نور در طول موج متناظر است.

مفسر
اسپکتروفتومتر ها می توانند خروجی خود را به صورت های مختلف نمایش دهند، اما متداول تر است که آن را به کامپیوتر وصل کرده و برای آنالیز داده ها از نرم افزار استفاده کنند و آن را به صورت قابل کاربردی مانند نموداری از مقدار عبور یا مقدار جذب برحسب طول موج نمایش می دهند.

انواع دیگر اسپکتروفتومتر ها

تک پرتو و دو پرتو
اسپکتروفتومتر ها به دو دسته تقسیم می شوند : تک پرتو و دو پرتو.
اسپکتروفتومتر های تک پرتو اولین نسل اسپکتروفتومتر ها بوده و تمام نور از بین نمونه عبور می کند، در این نوع برای اندازه گیری شدت نور تابشی باید به این نکته توجه داشت. این اسپکتروفتومتر ها ارزان هستند چرا که بخش های کمتری داشته و سیستم آنها پیچیدگی کمتری دارند. نسل جدید اسپکتروفتومتر ها نوع دو پرتو است. در این نوع نور قبل از این که به نمونه برسد به دو پرتو مجزا تفکیک می شود که این مسئله یک امتیاز تلقی می شود زیرا خواندن منبع و نمونه به طور همزمان انجام می شود. در برخی از اسپکتروفتومتر های دو پرتو، دو آشکارساز وجود دارد بدین ترتیب امکان اندازه گیری همزمان پرتو های نمونه و مرجع فراهم می شود. سایر اسپکتروفتومتر های دو پرتو، که تنها یک آشکارساز دارند از برشگر پرتو استفاده می کنند که این وسیله در هر لحظه یک پرتو را سد کرده و آشکارساز اندازه گیری پرتو نمونه و مرجع را به صورت یک در میان انجام می دهد.

نور مرئی
محدوده نور مرئی حدود 700-400 نانومتر است. اسپکتروفتومتر های ناحیه مرئی دقت و صحت متغیری دارند. برخی از آنها آشکارساز CCD با پیکسل های کافی برای قرائت هر nm10 را دارند، در حالیکه برخی دیگر می توانند در هر نانومتر چندین قرائت انجام دهند. این اسپکتروفتومتر ها می توانند از منابع نور سیمابی، هالوژن، LED یا ترکیبی از این منابع مثل LED تقویت شده با رشته های تنگستن استفاده کنند.
نور ماورا بنفش

                                                     شکل1 

اسپکتروفتومتر هایUV علاوه بر اینکه در طیف سنجی مایعات بسیار متداول است، برای گاز ها و همچنین جامدات نیز استفاده می شود. نمونه را در محفظه مستطیلی مخصوص که معمولا یک سانتیمتر پهنا دارد قرار می دهند. این محفظه که کاوت(Cuvvette) نامیده می شود می تواند شکل پلاستیک، شیشه یا کوارتز داشته باشد. پلاستیک و شیشه، UV را جذب می کنند از اینرو تنها می توان آنها را برای اسپکتروفتومتر های نور مرئی استفاده کرد. (شکل 1)

اصول نگهداری و کالیبراسیون اسپکتروفتومتر (طیف سنج نوری)

 اسپكتروفتومتر (Spectrophotometer) يا طيف سنج يك دستگاه آزمايشگاهي اوليه است كه جهت خواندن نتايج آزمايش‌هايي كه واكنش آن‌ها از نوع End point هستند به كار مي‌رود. اين دستگاه ميزان جذب يا عبور طول موج‌هاي مشخصي از انرژي تابشي (نور) از يك محلول را اندازه گيري مي‌كند بيشترين كاربرد آن در آزمايشگاه، در بخش بيوشيمي است.اساس كار اسپكتروفتومتر همانند بسياري از دستگاه‌هاي آزمايشگاهي، بر اندازه گيري ميزان نور جذب شده توسط يك محلول رنگي است كه طبق قانون بير-لامبرت ميزان جذب نور (OD) متناسب با غلظت ماده حل شده در محلول است.

كووت

كــووت‌هــا مـحـفـظــه‌هــاي شـفــافــي هـستنـد كـه مـحـلـول مـورد آزمـايـش در آن ريـخـتـه شـده و در جايگاه خاص خود كه در مسير نور تكرنگ تعبيه شده است قرار مي‌گيرد. كووت‌ها با توجه به نوع مصرف، جنس، شكل و حجم متفاوتي دارند. براي مـحـلــول‌هــاي اسـيــدي و قـلـيــايـي از كـووت‌هـاي مـخـصوص شيشه‌اي و براي طول موج‌هاي زير 320 نـانـومـتـر از لـولـه كوارتز يا پلاستيك استفاده مي‌شود.

كاليبراسيون
كاليبراسيون اسپكتروفتومتر، فرايندي است كه در آن مراحلي جهت تضمين صحت كار دستگاه به‌كار گرفته مي‌شود. اين روش تضمين مي‌كند كه اندازه گيري‌هاي به دست آمده توسط وسيله مورد نـظــر دقـيــق هـسـتـنــد. روش كــالـيـبــراسـيــون بــراي مدل‌هاي مختلف متفاوت است با اين حال اكثر تـولـيـدكـنـنـدگـان كـتـابـچـه راهـنـمـايـي را كـه شـامل جزئيات كاليبراسيون و نحوه كار با دستگاه است، براي استفاده كاربران فراهم مي كنند.
 اسپكتروفتومتر قادر است تا به عنوان فرستنده و گـيــرنــده نــور عـمـل كنـد. ايـن وسيلـه بـراي آنـاليـز نمونه‌هايي از ماده تست، توسط عبور نور از درون نمونه و خواندن شدت طول موج‌ها مورد استفاده قــرار مــي‌گـيــرد. نـمــونــه‌هــاي مـخـتـلـف نـور را بـه روش‌هـاي مختلـف فشـرده مـي‌كننـد و بـه محقق اجازه مي‌دهند تا توسط بررسي رفتار نور هنگام عبور از نمونه مورد نظر، با ساختار آن بيشتر آشنا شوند. در كاليبراسيون اين وسيله، از يك محلول مرجع جهت تنظيم صفر دستگاه استفاده مي‌شود.  در اسپكتروفتومتر تك پرتويي، يك پرتو نور توليد و دستگاه بايد بعد از هر بار استفاده، كاليبره شود. در نــوع دو پــرتـويـي، پـرتـوهـا از طـريـق نمـونـه تسـت فرستاده مي‌شوند و نمونه مرجع در همان زمان، دو مجموعه از نتايج را كه مي‌تواند به عنوان مرجع و كـــالــيـبــراسـيــون اسـتـفــاده شــود، تــولـيــد مــي‌كـنــد. كـالـيبراسيون مي‌تواند در آزمايشگاه توسط افراد باتجربه نيز صورت گيرد. البته اگر دستگاه دچار آسيب يا مشكل جدي شود، بايد جهت تعمير و تنظيمات اوليه به كارخانه سازنده يا نمايندگي‌هاي معتبر ارجاع داده شود. 
1- دستگاه را روشن كنيد و 10 دقيقه منتظر بمانيد تا دستگاه گرم و آماده به كار شود.
2- نور محفظه را تغيير دهيد تا به طول موج مورد نظر برسيد.
3- كووت را تا نيمه با محلول واكنش پر كنيد. كووت نبايد حاوي نمونه ناشناخته باشد.
4- دو طرف كووت را با دستمال پاك كنيد.
5- آن را در مـحـفـظــه قــرار دهـيـد و درب آن را ببنديد.
6- منتظر بمانيد تا اندازه گيري تمام شود.

ارزيـابـي صـحـت طـول مـوج به منظور ارزيابي ادعـاي سـيـسـتـم درتـابـاندن طول موجي است كه دستگاه براي آن تنظيم شده است. 
‌راحت‌ترين و قابل دسترس‌ترين  روش براي اسپكتروفتومترهايي كه با نور مرئي كار مي‌كنند، اســتــفـــاده از مـحـلــول سـيــان‌ مــت ‌هـمــوگـلــوبـيــن (20 ميكروليتر خون و 5 ميلي ليتر درابكين ) بوده كه داراي حــــداكــثــــر جــــذب نـــوري در طـــول مـــوج 540 نانومتر است. ابتدا با محلول درابكين به عنوان بلانك دستگاه را صفر كرده و سپس جذب نوري نمونه در طول موج 530 ، 535،  540 ، 545  و  550 نـانـومـتـر قـرائـت مـي‌شـود. بر‌‌اساس طول موج و مـيـزان جـذب ،يـك مـنـحـنـي رسـم مي‌شود كه در صورت وجود صحت طول موج ، حداكثر جذب نوري را در 540 نانومتر نشان خواهد داد.

آزمون رانش فوتومتری
يكي از منابع اصلي خطا در اسپكتروفتومتري، كــه بــه عـلـت فـرسـودگـي شـديـد مـنـبـع نـوري رخ مي‌دهد، عدم پايداري مقدار جذب خوانده شده درطول زمان است. براي بررسي، ابتدا دستگاه را با درابـكـيــن صـفــر كــرده و پــس از ريـخـتـن محلـول سيان‌مت هموگلوبين در كووت و بستن درب آن با پارافيلم، جذب نوري اين محلول هر 5 تا 15 دقيقه يك‌بار (به مدت يك ساعت) قرائت كنيد. حداكثر تغيير مجاز در جذب‌هاي نوري قرائت شده طي اين مدت 005/0-+‌  است. به عنوان مثال اگرجذب محلولي در ابتدا 259/1‌ باشد، در مدت يك ساعت مي‌تواند در محدوده 005/0‌ -+‌  259/1‌ تغيير كند.

نحوه كار با اسپكتروفتومتر D 20/20
1- دستگاه را روشن كنيد. اجازه دهيد تا به مدت 15 دقيقه گرم شود. 
2- طول موج مورد نظر را با دكمه قرار گرفته در كنار محفظه نمونه تنظيم كنيد.
3- محفظه نمونه را بررسي كنيد تا از خالي بودن آن مطمئن شويد. دكمه مربوط به تنظيم صفر را كه در جـلـو و سـمـت چـپ اسـپـكـتـروفـتـومـتـر اسـت، بچرخانيد تا مقدار صفر را نمايش دهد.
4- براي اطمينان از پاكيزگي و كاهش اشتباه در نتايج اندازه گيري، از دستكش استفاده كنيد.
5- 4/3 كووت را با آب مقطر پر كنيد و آن را در نگـه دارنـده قـرار دهيد. كووت را به سمت پايين فشار دهيد تا در جاي خود تراز شود. دقت كنيد كه خارج كووت تميز و خشك باشد.
6- دكمه كنترل نور را كه در جلو و سمت راست دستگـاه قـرار دارد، بچـرخانيد تا مقدار عبوري يا جذب را بخواند.
7- سپس كووت نمونه را در محفظه قرار دهيد. مقدار نشان داده شده را ثبت كنيد.

كاليبراسيون اسپكتروفتومتر مادون قرمز
اسپكتـروفتومتر مادون قرمز از پلي استايرن به عنوان يك استاندارد كاليبراسيون استفاده مي كند. A-Scan ابــزار بــا يــك قـطـعــه از پـلــي استـايـرن در نگه‌دارنده نمونه، حضور قله‌هاي ديده شده روي طيف IR و شدت نسبي قله‌ها را بازبيني مي‌كند.
1- اسپكتروفتومتر را روشن كرده و جهت ثبات دستگاه، اجازه دهيد تا 10 دقيقه گرم شود. بدون وجود منبع پايدار، نمي توان بر طيف به دست آمده اعتماد كرد.
2- اسـتـانـدارد كـالـيـبـراسيون را توسط قراردادن نمونه‌اي از فيلم پلي استايرن در نگه دارنده نمونه انجام دهيد. بدون اجراي آزمون با استفاده از يك نـمـونه از طيفي شناخته شده كه استاندارد ناميده مي‌شود، نمي‌توانيد در مورد درستي و صحت كار دستگاه به يقين برسيد.
3- طيف را براي نمونه پلي استايرن بازيابي كنيد. طيف را با يكي از مراجع استاندارد طيف IR مقايسه كنيد تا مطمئن شويد كه همه قله‌هاي مورد انتظار روي طيف آزمون وجود دارد.
4- طـيـف را بـررسـي كـنـيـد تـا مطمئن شويد كه قدرت سيگنال درون 95% از حداكثر قوي‌ترين قله است.
5- ميرايي را تنظيم كنيد تا به سيگنال صحيح و مورد نظرتان دست يابيد.

توجه
‌مـمـكن است فيلترهاي نوري خاصي براي تـعـدادي از دسـتـگاه‌ها نياز باشد كه با طول موج ويژه‌اي كار مي‌كنند. 
‌اگر طول موج تغيير كرده است يا بعد از هر نمونه‌گيري، بايد صفر دستگاه تنظيم شود.

‌اطمينان حاصل كنيد كه كووت‌ها خالي از هرگونه ذرات، لكه يا اثر انگشت است. اين مورد مي‌تواند محاسبات دستگاه را تحت تاثير قرار دهد.
‌اسـپـكـتــروفـتــومـتـرهـا گـران هستنـد. مـراقـب باشيد تا به آن‌ها صدمه‌اي وارد نشود.

بررسی های روزانه
اتـصـالات الـكـتريكي را به طور كامل بازرسي كنيد تا هيچ گونه ساييدگي نداشته باشند.
تحت هيچ شرايطي كاركنان مجاز به بازكردن دستگاه نيستند.
هرگونه مايعات خارجي و مواد شيميايي ريخته شده را از روي دستگاه و قسمت‌هاي مجاور آن، پاك كنيد.
نگه دارنده نمونه را مخصوصا بعد از به كاربردن محلول‌هاي نمكي يا خورنده به دقت تميز كنيد.
كــــووت‌هــــا را بـــلافـــاصــلـــه بــعـــد از اســتــفـــاده بـشــوييـد.سپـس آن‌هـا را بـرعكـس كنيـد تـا كـامـلا خـشــك شــونـد. اجـازه نـدهـيـد نـمـونـه در كـووت خشك شود.

منبع: ماهنامه مهندسی پزشکی